Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол




Скачать 309.33 Kb.
НазваниеРегуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол
страница1/3
Дата конвертации29.11.2012
Размер309.33 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2   3


На правах рукописи


Золотарева Наталья Владимировна


Регуляция каталитической активности

алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами

Пирацетам, Зорекс и Унитиол


03.01.04 – биохимия


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Тверь – 2011

Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета



Научный руководитель

доктор химических наук, профессор

Лапина Галина Петровна




Официальные оппоненты:



доктор биологических наук, профессор Рабинович Галина Юрьевна


кандидат биологических наук, доцент Карцова Софья Владимировна





Ведущая организация



Самарский государственный медицинский университет








Защита диссертации состоится « 12 » мая 2011 года в 14 00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.263.08 при Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70/1Б, корп. 5, ауд. 318. 


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета по адресу: 170100, г. Тверь, ул. Володарского, 44 а.


Автореферат разослан «___» апреля 2011 года



Ученый секретарь

диссертационного совета



Н. В. Костюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность исследования. Одна из наиболее актуальных в физико-химическом аспекте проблем биохимии алкоголизма – регуляция активности алкогольдегидрогеназы (АДГ). В ряде исследований (Островский Ю.М., Сатановская В.И., Садовник М.Н., 1969; White, A.M., 1998; Нужный В.П., 2002 и др.) установлено, что в качестве субстрата фермента наиболее часто используется этанол. Достаточно полно изучен физиологический аспект действия этанола на организм человека (Бурков Ю.В., Иванова Н.Н., 2008), а также исследован ферментативный механизм утилизации этанола в организме человека (Груздева К. Н., 2001 и др.) при участии фермента алкогольдегидрогеназы. Однако вопросы регуляции ферментативной активности алкогольдегидрогеназы изучены недостаточно.

Алкогольдегидрогеназа – фермент класса оксидоредуктаз (1.1.1.1), катализирующий процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды (Диксон М., Уэбб Э., 2005). Алкогольдегидрогеназы найдены в тканях животных (печени лошади) (Xie P., 2005), растениях (томатах и картофеле), грибах, дрожжах, бактериях (Авилова Т.В., 2001) и др. Наиболее изученными ферментами являются алкогольдегидрогеназы, выделенные из дрожжей, а также печени лошади (Сапожников Г.П., Лозитнова А.Б., 2004; Лапина Г.П., Золотарева Н.В., 2006 – 2008).

Алкогольдегидрогеназы являются недостаточно исследованными биокатализаторами c точки зрения использования различных фармпрепаратов, применяемых для лечения больных хроническим алкоголизмом (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 2002). До настоящего времени актуальным является поиск специфических эффекторов фермента алкогольдегидрогеназы, окисляющих этанол, с целью регулирования концентрации этанола и ацетальдегида в организме, что важно в изучении молекулярных основ биохимии алкоголизма (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 1984; Марри Р., Греннер Д., 1993; Goldberg L., Rudberg U., 2004).

Вопросы изучения и установления молекулярных механизмов такого рода эффекторов (активаторов или ингибиторов фермента) относятся к перспективным направлениям современной энзимологии и обсуждались на Symposium of A.I. Oparin: «Biochemistry of the twenty-first century: problems and frontiers», 1994; а также в работах (Бонитенко Е.Ю., 2003; Zidoni Е., Кrеter M., 2004 и др.). Поиск решения поставленной задачи и определяет актуальность данной работы.

В практической медицине довольно широко используются фармпрепараты Пирацетам и Зорекс (Wyllie M. G., Paciorec P. M., 2001; Waterfall J. F., 2003). Физиологические основы действия данных регуляторов известны: Пирацетам, являясь ноотропным фармпрепаратом, изменяет метаболические и биоэнергетические процессы в нервной клетке, улучшает функции головного мозга, усиливая кровоток (Руденко Г. М., 1996; Benzi G., Pastoris O., 1997); Унитиол, в свою очередь, в составе Зорекса способствует восстановлению обмена веществ в нервных клетках и выведению продуктов распада этанола из органов и тканей (Ostrovskaja R. U., Hoffmann W., Molodawkin G. M., 1993; Roglev M., 2001).

Эффективное использование этих фармпрепаратов базируется на информации о молекулярно-кинетическом характере их действия на фермент АДГ, который в полной мере не изучен.

Цель работы: исследование молекулярно-кинетического механизма действия фармакологических препаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола (составной части Зорекса) на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в условиях in vitro.

Задачи исследования:

  1. Выделить и очистить алкогольдегидрогеназу из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова. Определить субстратную специфичность фермента в группе этанол-бутанол-изопропанол и рассчитать его основные ферментативные параметры и выявить оптимальную концентрацию специфичного субстрата. Сравнить ферментативные показателей алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей и алкогольдегидрогеназы печени лошади.

  2. Разработать многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в присутствии регуляторов и оптимизировать его:

- рассчитать значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади для системы контроля;

- выявить влияние Пирацетама и никотинамидадениндинуклеотида на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы. Найти их оптимальные концентрации;

- определить действие Зорекса и Унитиола на активность биокатализатора.

  1. Установить тип регулирования (активации или ингибирования) алкогольдегидрогеназы в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола.

  2. Для изученных ферментативных систем построить геометрический «портрет» в трехмерной Kм' V' – системе координат и на этой основе рассчитать дополнительный ферментативный параметр (длину -, -, - векторов).

Научная новизна результатов исследования

Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению влияния фармакологических препаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол на каталитическую активность АДГ.

Впервые выявлены типы активации АДГ при действии на фермент фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола и установлена эффективность функционирования биокатализатора на основе векторных построений данных ферментативной кинетики в трехмерной Kм'V' – системе координат, позволивших впервые получить визуализацию хода ферментативного процесса с участием АДГ в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола и рассчитать новый ферментативный параметр – длину вектора, характеризующего интенсивность активации фермента и отражающего суммарную эффективность функционирования биокатализатора.

Теоретическая и практическая значимость работы. Работа носит фундаментальный характер и направлена на изучение молекулярно-кинетического поведения алкогольдегидрогеназы.

Полученные данные в рамках разработанного в данной работе многоэтапного научно-методического подхода расширяют и развивают теоретические представления об эффективности регулирования биокатализа в присутствии различных добавок.

Разработанная схема изучения типа регулирования (активации или ингибирования) АДГ для фармакологических препаратов (Пирацетам, Зорекс и Унитиол), направленная на поиск оптимальных условий течения ферментативной реакции, может служить моделью для изучения других фармпрепаратов, действующих на фермент утилизации этанола – алкогольдегидрогеназу – с целью устранения последствий интоксикации организма.

Часть полученных данных и сделанные выводы использованы при выполнении проекта № 2.1.1/1897 «Исследование взаимосвязи структурно-динамических свойств ферментов с их функциональной активностью и разработка новых биокатализаторов на основе иммобилизованных окислительно-восстановительных ферментов для биомедицинской и пищевой промышленности», выполняемого по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)». (Заказчик проекта – Министерство образования и науки Российской федерации, Федеральное агентство по образованию).

Научные результаты, выносимые на защиту:

1. Максимальная субстратная специфичность выделенной и очищенной из пекарских дрожжей алкогольдегидрогеназы среди спиртов различного строения наблюдается к этиловому спирту. Рассчитаны значения важнейших ферментативных параметров биокатализатора (Кm, Vmax и Kкат). Выявлена оптимальная концентрация специфичного субстрата – этанола, равная 1,5·10-2М.

2. Разработанный многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы позволил установить, что фармпрепарат Пирацетам как активатор алкогольдегидрогеназы обладает большей эффективностью в сравнении с Зорексом и Унитиолом.

3. Пирацетам, Зорекс и Унитиол по-разному активируют алкогольдегидрогеназу, а именно в случае Пирацетама – двухпараметрически рассогласованный тип активации (IIa-тип, Крупянко В.И., 1994), для Зорекса и Унитиола – двухпараметрически согласованный тип активации (Ia-тип, Крупянко В.И., 1994) фермента.

4. Расчет дополнительного ферментативного параметра – значения длины вектора – на основе векторного построения геометрического «портрета» алкогольдегидрогеназной реакции подтвердил наибольшую эффективность фармпрепарата Пирацетама в сравнении с Зорексом и Унитиолом.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Полученные результаты соответствуют пункту 4 паспорта специальности 03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».

Апробация и реализация результатов диссертации

Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на V и VII научных конференциях аспирантов и студентов химического факультета (Тверской государственный университет, Тверь, 2006 и 2008); на XVI и XVII Региональных Каргинских чтениях «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный университет, Тверь, 2009 и 2010); на Международной конференции «Состояние воды в биологических и модельных системах» (Тверская государственная медицинская академия, Тверь, 2007); Всероссийской научной школе для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных органических соединений» (Тверская государственная сельскохозяйственная академия, Тверь, 2010), а также на научных семинарах кафедры физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ и при выполнении дипломных работ, в которых соискатель был научным руководителем дипломников.

Полученные результаты по выявлению особенностей ферментативного поведения алкогольдегидрогеназы печени лошади и оптимизации метода выделения фермента из пекарских дрожжей используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганической экспертизы ТвГУ: в курсе лекций, при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.

Публикации. Результаты исследования отражены в 9 публикациях, 3 из которых в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 источника, из которых 70 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 68 рисунками.


ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ


– Алкогольдегидрогеназа печени лошади – очищенный гомогенный коммерческий препарат фирмы «Reanal» (Венгрия).

– Алкогольдегидрогеназа пекарских дрожжей (выделен по методу Г.А. Кочетова).

– Фармакологический коммерческий препарат Пирацетам (2-оксо-1-пирролидинилацетамид) фирмы ОАО «Фармстандарт – УфаВита» (Россия) (в ампулах).

– Фармакологические коммерческие препараты Зорекс (Унитиол–2,3-димеркаптопропансульфонат натрия и кальция пантотената) (в капсулах) и Унитиол – фармпрепараты фирмы «Valenta» (Россия) (в ампулах).

– Сывороточный альбумин человека (САЧ) коммерческий препарат, лиофилизованный из человеческой сыворотки, фирмы «Reanal» (Венгрия).


В работе использованы следующие методы:

Метод выделения и очистки АДГ (метод Г.А. Кочетова, 1998) с некоторыми собственными изменениями методики (с использованием буферных растворов рН 6,0 и 7,5; тепловой обработки при 35ºC). Схема выделения и очистки АДГ дана на рис.1. Выделение фермента АДГ из пекарских дрожжей вели в течение трех недель.



Рис.1. Схема выделения и очистки АДГ из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова с собственными модификациями


Метод калибровочного графика, построенного по белку-стандарту – коммерческому препарату сывороточный альбумин человека (рис.2), применяли для оценки и расчета концентрации ферментативно-активного белка.

Метод определения ферментативной кинетической активности АДГ. При окислении этилового спирта образуется восстановленный НАД, количество которого определяли фотометрически.

АДГ

С2Н5ОН+НАД + → СН3СНО + НАД·Н + Н+

Измеряли увеличение значения оптической плотности (D) при длине волны 340 нм во времени (t). Контрольная кювета не содержала субстрата. Активность рассчитывали исходя из данных, полученных в течение 15—45 с хода ферментативной реакции.

Метод ЛайнуивераБерка для обработки данных ферментативной кинетики и расчета важнейших ферментативных параметров: Km – константы Михаэлиса, Vmax – максимальной скорости реакции и Kкат – константы каталитической. В ходе ферментативной реакции рассчитывали начальные скорости реакций по зависимостям оптической плотности (D) во времени (t), строили прямые в координатах Лайнуивера–Берка (1/V и 1/[S]) и вели расчет важнейших ферментативных параметров – Кm, Vmax и Kкат.

Метод векторных диаграммных построений. В трехмерной Kм'V'-системе прямоугольных координат каждая ингибируемая или активируемая ферментативная реакция получает свое векторное представление конкретный трехмерный вектор L этой реакции. При этом длина данного вектора характеризует интенсивность протекания ферментативной реакции: положение L вектора в системе координат – тип изучаемой реакции, направление смещения – тенденцию к смене типа реакции, а траектория, описываемая подвижным концом вектора, – геометрический «портрет» изучаемой реакции.


ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ


Изученные ферментативные системы:

Ферментативная система-1 (система контроля): АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,5×10-2М), НАД различных концентраций (5,0; 4,5; 4,0; 3,5; 2,5; 1,5)×(10-2М).

Ферментативная система-2 состоит из АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанола С2Н5ОН (1,5×10-2М), НАД (1,5×10-2М) при различных концентрациях Пирацетама (0,5–4,5)×(10-2М).

Ферментативная система-3, включающая фермент АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанол С2Н5ОН (1,5×10-2М), Пирацетам (1,5×10-2) при варьировании концентрации НАД (0,5–4,5)×(10-2М).

Ферментативная система-4 состоит из АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанола С2Н5ОН (1,5×10-2М), Зорекса (5·10-2М) при варьировании концентрации НАД (1,5–5,0)×(10-2М).

Ферментативная система-5: фермент АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанол С2Н5ОН (1,5×10-2М), Унитиол (5·10-2М) (как составная часть Зорекса) при варьировании концентраций НАД (1,5–5,0)×(10-2М).

Первый этап работы, изложенный в пункте 4.1 диссертации, посвящен выделению и очистке АДГ из пекарских дрожжей (рис. 1) по методу Г.А. Кочетова с собственными изменениями. Изучена субстратная специфичность АДГ в группе различных субстратов (этиловый, бутиловый и изопропиловый спирты). Определены важнейшие ферментативные параметры – Кm, Vmax и Kкат, найдена оптимальная концентрация этанола.

По калибровочной зависимости (рис. 2) рассчитали содержание ферментативно активного белка в полученных экстрактах. Для значения величины оптической плотности (D), равной 0,50 опт. ед., по калибровочной кривой нашли значение концентрации фермента, составившее 8,42·10-5 г белка /г сырой массы дрожжей или 2,41·10-4М.



  1   2   3

Добавить в свой блог или на сайт

Похожие:

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconИсследование каталитической активности супрамолекулярных систем
Иофх (Л. А. Кудрявцева, Л. Я. Захарова, И. С. Рыжкина) проведены систематические исследования кинетики реакций нуклеофильного замещения...

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconКурса «Общая психология» (разделы «Потребности и мотивация, эмоциональная регуляция поведения, волевая регуляция поведения»)
Выписка из образовательного стандарта по дисциплине «Общая психология» (часть стандарта)

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconПрограмма всероссийской конференции с международным участием
Современный научный уровень разработок по каталитической очистке газовых выбросов мобильных источников

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconОбмен веществ, мясные и воспроизводительные качества индеек при скармливании комбикормов, обогащенных пробиотическим и витаминным препаратами

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconОбработка яиц кур биологически активными препаратами для стимуляции резистентности цыплят на различных стадиях онтогенеза

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconИерархические и инверсивные отношения в структуре активности человека
...

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconУчебником. Оборудование
Урок: Регуляция процессов жизнедеятельности организмов и их связей с окружающей средой. (8 класс)

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconЛитература по каучуку и резине за январь март 1990 года
Аксенов В. И., Золотарева И. В., Арест-Якубович А. А. Синтез низкомолекулярного 1,2-полибутадиена под дей­ствием каталитической системы...

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconПрограмма съезда 27-29 июня 2012 г
Ю. М. Захаров (Челябинск). Регуляция эритропоэза в эритробластических островках костного мозга

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconДиагностика уровня творческой активности учащихся
Цель: на основе выявленных критериев и эмпирических показателей провести сравнительный анализ изменений в сформированности у учащихся...


Разместите кнопку на своём сайте:
lib.convdocs.org


База данных защищена авторским правом ©lib.convdocs.org 2012
обратиться к администрации
lib.convdocs.org
Главная страница