Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол




Скачать 309.33 Kb.
НазваниеРегуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол
страница2/3
Дата конвертации29.11.2012
Размер309.33 Kb.
ТипАвтореферат
1   2   3

Рис. 2. Калибровочная зависимость оптической плотности (D) от концентрации белка (С)

сывороточного альбумина человека («Reanal», Венгрия)


Для изучения субстратной специфичности использовали водные растворы различных субстратов: этанола, изопропанола и бутанола-1, концентрации которых меняли в интервале (1,5–6,0)·10-2М. Далее определяли кинетику течения биокаталитической реакции по изменению величины оптической плотности (D) во времени (t). В качестве примера на рис. 3 представлены зависимости D~t для водного раствора субстрата этанола концентраций и (·10-2М) 6,0 и 1,5.






Рис. 3. 3асимости оптической плотности (D) во времени (t) окисления субстрата-этанола водным раствором АДГ (2,41·10-4М) печени лошади для концентраций (·10-2М) субстрата: a – 6,0 и b –1,5


На основе кинетических зависимостей (рис. 3) рассчитывали начальные скорости АДГ-зависимых ферментативных реакций (V0), которые спрямляли в координатах двойных обратных величин (координатах Лайнуивера–Берка) (рис. 4).





Рис. 4. Зависимость обратных величин начальных скоростей от обратных величин концентраций субстратов этанола (·) и НАД – () для водного раствора АДГ дрожжевой (2,41·10-4М)


На основе рис. 4 провели расчет значений Km, Ккат и Vmax для водного раствора фермента (2,41·10-4М), которые составили, соответственно, (2,85 ± 0,19)·10-5М; (9,23 ± 0,18)·10-2с-1 и (3,86 ± 0,18)·10-5опт.ед./с. Полученные характеристики корректно согласуются с данными литературы (Xie P., Parsons S.H., Speckhard D.C., 1997), что указывает на достоверность полученных данных.

По вышеприведенной схеме определены ферментативные параметры для двух других субстратов: бутанола-1 и изопропанола (табл.1). В ряду субстратов-спиртов (этанол, бутанол-1 и изопропанол) численные значения Km возрастают в 3,2 раза и уменьшаются в 1,6 раза значения Vmax. Это означает, что в изученной группе субстратов АДГ: этанол – бутанол-1 – изопропанол, – сродство их к ферменту постепенно снижается. Для этанола найдена максимальная активность АДГ дрожжевой (Vmаx), минимальная – для изопропанола.

Таблица 1

Рассчитанные параметры ферментативной активности АДГ дрожжевой для водных растворов различных спиртов субстратов

Субстрат

Кm,·10-5 М

Vmax,·10-5 опт.ед./с

Ккат,·10-2 с-1

Этиловый спирт

2,85±0,19

3,86±0,18

9,23±0,18

Бутиловый спирт

6,67±0,21

2,47±0,21

6,19±0,21

Изопропиловый спирт

9,09±0,20

1,49±0,20

3,47±0,20


Активность (Ккат) по бутанолу-1 и изопропанолу уменьшается в 1,5 и 2,5 раза по сравнению со скоростью окисления этанола. Таким образом, обнаружено, что с различными субстратами биокатализ идет по-разному, что свидетельствует о наличии субстратной специфичности АДГ дрожжевой. Выявлен наиболее оптимальный субстрат – этанол, для которого значение Ккат максимально и составляет (9,23±0,19)·10-2с-1.

Следует отметить, что изучение ферментативного процесса, катализируемого АДГ, при варьировании концентрации второго компонента субстрата – НАД – позволило получить значения Km и Vmax близкие к тем, что были рассчитаны для ферментативной системы при варьировании второго компонента субстрата-этанола.

Полученные данные согласуются с (Hurley T.D., Bosron W.F., Stone C.L., 1994), где определена субстратная специфичность для АДГ, выделенной из других природных источников (растений и грибов), что подтверждает универсальность полученных результатов.

На первом этапе исследовательской работы разработаны собственные эффективные модификации метода выделения и очистки фермента. Освоен и применен кинетический метод определения ферментативных параметров алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей, а также изучена и установлена субстратная специфичность АДГ дрожжевой, т.е. оптимизированы условия для выполнения последующих этапов дальнейшей работы.

На втором этапе работы определены кинетические параметры каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в системе контроля (сравнения), включающей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,5×10-2М), но при варьировании концентрации НАД (0,5–5,5)×10-2М (ферментативная система-1). В ходе определения активности АДГ печени лошади построены кинетические зависимости изменения оптической плотности (D) во времени (t) в системе контроля для следующих концентраций НАД (0,5–5,5)×10-2М. Кинетические зависимости имели стандартный вид кривых с насыщением. По освоенной схеме построены спрямленные кинетические зависимости в координатах Лайнуивера–Берка и рассчитаны параметры Кm, Ккат и Vmax для ферментативной системы-1, включающей АДГ печени лошади (табл. 2).

Таблица 2

Показатели ферментативной активности АДГ пекарских дрожжей и АДГ печени лошади при использовании водного раствора

субстрата этилового спирта




Km,·10-5 М

Vmax,·10-5 опт.ед./с

Ккат, ·10-1с-1

АДГ пекарских дрожжей

2,85±0,19

3,86±0,18

9,23±0,18

АДГ печени лошади

2,51±0,17

3,51±0,17

8,94±0,17


По особенностям построения первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур (Forsht A.., 1995) а также по механизму каталитического действия (Курганов Б.И., 2008) эти два фермента (АДГ дрожжевая и АДГ печени лошади) практически идентичны. Близкие значения ферментативных параметров АДГ дрожжевой и АДГ печени лошади позволили провести исследование по влиянию эффекторов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола) на АДГ печени лошади (коммерческий препарат) в модельных системах.

На третьем этапе исследовано влияние фармакологического препарата Пирацетама на каталитические параметры АДГ печени лошади в ферментативной системе-2, содержащей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,5×10-2М), Пирацетам (1,5×10-2М) при варьировании концентрации НАД (0,5–4,5)×10-2М и в ферментативной системе-3, включающей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,5×10-2М), НАД (1,5×10-2М) при различных концентрациях Пирацетама (0,5–4,5)×10-2М. Для сравнения кинетических параметров в ферментативной системе-2 и ферментативной системе-3 применили три способа изучения ферментативных характеристик биокатализатора:

1. Оценочный по выявлению возможного влияния и Пирацетама, и НАД (при варьировании их концентраций) на каталитическую активность АДГ печени лошади посредством анализа кинетических кривых D~t. На кривых D~t определяли Vmаx и строили зависимости в координатах Vmаx – концентрация Пирацетама.

2. В рамках классической энзимологии строили кинетические зависимости D~t. К начальным участкам полученных кривых проводили касательные и определяли начальные скорости (V0). Экспериментальные данные обрабатывали, используя способ, предложенный Лайнуивером–Берком, и рассчитывали важнейшие ферментативные параметры Vmаx, Km и Kкат.

3. Построение геометрического «портрета» изучаемой реакции, катализируемой АДГ, в трехмерной Kм'V' системе прямоугольных координат для расчета дополнительных ферментативных параметров (длин -, -, - векторов).

Для ферментативной системы-2 в рамках 1-го способа находили концентрацию Пирацетама, при которой активность АДГ максимальная. Для этого посредством изучения кривых D~t рассчитали значение Vmаx и строили экспериментально полученную зависимость в координатах Vmаx – концентрация Пирацетама (рис. 5).


Рис. 5. Влияние концентрации Пирацетама на скорость фермента-тивной реакции (Vmаx), катализируемой АДГ (2,41·10-4М), кинетика которой описывается уравнением Михаэлиса Ментена


Обнаружили, что концентрация Пирацетама влияет на активность АДГ печени лошади, причем оптимальной является концентрация эффектора, равная 1,5·10-2М, при которой значение Vmаx составляет (19,80±0,32) ×10-5опт.ед./с.

Обработка экспериментальных данных по 2-му способу с использованием координат Лайнуивера–Берка позволила получить следующие значения биокаталитических характеристик для ферментативной системы-2: Кm = (8,47 ± 0,37)·10-5 моль/л; Vmах = (20,01 ± 0,37)·10-5 опт.ед./с; Ккат = (8,71 ± 0,37)·10-5с-1.

Таким образом, обнаружена корреляция значений ферментативных параметров Vmax, рассчитанных при использовании 1-го и 2-го способов, а именно значение Vmax по 1-му способу равно (19,80±0,32)·10-5 опт.ед./с, а по 2-му – (20,01±0,37) ·10-5 опт.ед./с (табл.3).

Итак, введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом (значение Km на 71 % больше, чем в системе контроля), но улучшает течение каталитической реакции, а именно в 5,7 раз возрастает значение Vmax при использовании 1-го и 2-го способов.


Таблица 3

Рассчитанные каталитические характеристики фермента АДГ печени лошади (2,41·10-4М) для концентрации Пирацетама 1,5·10-2М при рН 6,0

Ферментативные параметры

1-й способ

2-й способ

Система контроля

Кm, ·10-5М

-

8,47±0,37

2,51±0,17

Vmах, ·10-5

опт.ед./с

19,80±0,32

20,01±0,37

3,51±0,17


В результате введения в ферментативную систему Пирацетама (1,5·10-2М) повышается активность АДГ, что, возможно, может привести к усиленному окислению этанола в организме человека и, следовательно, к уменьшению его интоксикации (Consalvi V., 1998; Gough W.H., 2001).

В связи с тем, что важная роль в биокаталитической реакции принадлежит НАД, необходимо определить оптимальную концентрацию этого компонента в модельной ферментативной системе. Для этого изучали возможное влияние различных концентраций НАД на активность АДГ печени лошади посредством анализа кинетических кривых D~t. Это позволило построить зависимость начальной скорости реакции (Vо) от концентрации НАД (рис.6).




Рис 6. Зависимость максимальной скорости реакции от концентрации НАД для ферментативной системы-3


Значение концентрации НАД, составляющей 1,5·10-2М, является оптимальным для ферментативной системы-2, поскольку зависимость имеет вид кривой с насыщением (рис. 6).

Рассчитали следующие значения Кm, Ккат и Vmах для ферментативной системы-3 (рН 6,0), содержащей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), Пирацетам (1,5·10-2М), С2Н5ОН (1,5·10-2М) и НАД (0,5–4,5)×10-2М и сравнили с полученными кинетическими параметрами для ферментативной системы-2 (табл. 4).


Таблица 4

Кинетические параметры ферментативной реакции (Km и Vmax)

для водных растворов АДГ, рассчитанные по двум способам (1-й и 2-й) для ферментативной системы-2 и ферментативной системы-3




Кm,·10-5 моль/л

Vmax, ×10-5 опт.ед./с

1-й способ

2-й способ

1-й способ

2-й способ

Ферментативная система-2

-

8,47±0,39

19,80±0,32

20,01±0,39

Ферментативная система-3

5,89±0,39

5,03±0,39

11,78±0,38

12,01±0,38

Система контроля

2,51±0,17

3,51±0,17
1   2   3

Похожие:

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconИсследование каталитической активности супрамолекулярных систем
Иофх (Л. А. Кудрявцева, Л. Я. Захарова, И. С. Рыжкина) проведены систематические исследования кинетики реакций нуклеофильного замещения...

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconКурса «Общая психология» (разделы «Потребности и мотивация, эмоциональная регуляция поведения, волевая регуляция поведения»)
Выписка из образовательного стандарта по дисциплине «Общая психология» (часть стандарта)

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconПрограмма всероссийской конференции с международным участием
Современный научный уровень разработок по каталитической очистке газовых выбросов мобильных источников

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconОбмен веществ, мясные и воспроизводительные качества индеек при скармливании комбикормов, обогащенных пробиотическим и витаминным препаратами

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconОбработка яиц кур биологически активными препаратами для стимуляции резистентности цыплят на различных стадиях онтогенеза

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconИерархические и инверсивные отношения в структуре активности человека
...

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconУчебником. Оборудование
Урок: Регуляция процессов жизнедеятельности организмов и их связей с окружающей средой. (8 класс)

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconЛитература по каучуку и резине за январь март 1990 года
Аксенов В. И., Золотарева И. В., Арест-Якубович А. А. Синтез низкомолекулярного 1,2-полибутадиена под дей­ствием каталитической системы...

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconПрограмма съезда 27-29 июня 2012 г
Ю. М. Захаров (Челябинск). Регуляция эритропоэза в эритробластических островках костного мозга

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол iconДиагностика уровня творческой активности учащихся
Цель: на основе выявленных критериев и эмпирических показателей провести сравнительный анализ изменений в сформированности у учащихся...


Разместите кнопку на своём сайте:
lib.convdocs.org


База данных защищена авторским правом ©lib.convdocs.org 2012
обратиться к администрации
lib.convdocs.org
Главная страница