С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail




Скачать 78.88 Kb.
НазваниеС. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail
Дата конвертации01.12.2012
Размер78.88 Kb.
ТипДокументы
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ЛЮПИНА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ.


С. Ю. Гришин

Брянский государственный университет им. Акад. И.Г.Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail: greyxxxx@mail.ru


В современной селекции для выведения современных, устойчивых и высокопродуктивных сортов необходима разработка системы молекулярных маркеров хозяйственно-ценных признаков сельскохозяйственных культур. Использование белковых маркеров, в частности изоферментов, для анализа генотипов и сортов разных культур часто сопряжено с трудностями, прежде всего связанными с недостаточным уровнем межсортового полиморфизма белковых маркеров. В настоящее время разрабатываются методы молекулярно-генетического маркирования на основе ДНК, которые могут использоваться в селекционных целях, для паспортизации сортов и гибридов, установления родственных связей между ними и построения древа филогенетического родства разных видов, а также для оценки чистоты сортового посевного материала.

В исследованиях, связанных с молекулярным маркированием генома растений, хорошие результаты показывают методы полимеразной цепной реакции с ISSR-праймерами [4, 5, 6]. Этот метод отличается относительной простотой реализации и достаточной воспроизводимостью. Результатом амплификации является набор фрагментов, который может быть использован в качестве молекулярного маркера сорта [4].

Люпин является важнейшей зернобобовой культурой кормового сидерального направления. Семена содержат 35-52% белка, сбалансированного по аминокислотному составу, 5,3-20% масла, витамины, микро- и макроэлементы [2]. Зеленая масса безалкалоидных сортов люпина желтого и узколистного является хорошим кормом. Люпин накапливает в почве до 200 кг азота и является хорошим предшественником для ряда культур [3].

В России и в Европе в основном проводится селекция 3 видов люпина: L. albus (L.) -люпин белый, L. luteus (L.) - люпин желтый и L. angustifolius (L.) - люпин узколистный.

Целью настоящего исследования была разработка ДНК-маркеров на основе метода ISSR-PCR для выявления генетического полиморфизма и молекулярного маркирования десяти сортов L. angustifolius (L.) - люпина узколистного: Сидерат 38, СН 78-07, Снежеть, Витязь, Смена, Радужный, Кристалл, Вектор, Узколистный, Белозерный 121. Растительный материал для анализа был получен с селекционного питомника ВНИИ люпина РАСХН, селекционерами были предоставлены для анализа новые высокопродуктивные сорта и перспективные образцы люпина.


Методы

Выделение ДНК проводили из трех-четырехдневных проростков фенольным методом, приведенным в [7], модифицированным для данной культуры.

Определение концентрации полученного раствора ДНК проводили методом спектрофотометрии на приборе T70 UV/VIS Spectrometer (PG Instruments Ltd.), пользуясь для пересчета соотношением: 1 о. е. соответствует 50 мкг/мл ДНК.

PCR проводили в четырехканальном ДНК-амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Использовали ISSR-праймеры, синтезированные фирмой «Синтол» (Москва). Применялись ферменты и реактивы фирмы «СибЭнзим» (Москва).

Реакционная смесь для ISSR-PCR объемом 20 мкл содержала следующие компоненты: 2 ед. Taq-полимеразы E338, 2 мкл SE-буфера AS, 5 мМ MgCl2, 0,25 мМ каждого dNTP, 50 пМ каждого из праймеров, 300 нкг тотальной геномной ДНК. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла.

Условия амплификации были следующими: начальная денатурация 5 мин при 94°С, 35 циклов: денатурация при 94°С – 45 с, температура отжига 52°С – 45 с и элонгация при 72°С 90 с; заключительная элонгация 7 мин при 72°С. Температуру отжига праймеров определяли с помощью программы Vector NTI (Invitrogen).

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с буфером TBE в присутствии бромистого этидия и визуализировали на UV-трансиллюминаторе. На форез наносили одинаковый объем ПЦР-продуктов в 5 мкл. В качестве маркера молекулярной массы использовали M27, дающий фрагменты длиной 3000, 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 пар нуклеотидов. Учитывали как мажорные, так и минорные ПЦР-фрагменты. Воспроизводимые фрагменты ДНК, присутствующие на электрофореграммах не всех сортов, считались полиморфными.


Результаты


Настоящую работу провели на 10 сортах люпина узколистного. Для «чистоты эксперимента» ДНК-пробу выделяли и анализировали три раза из нескольких семян одного сорта. Для разработки ДНК-маркеров были выбраны 10 ISSR-праймеров из всех использованных (21) в исследовании. Выбранные праймеры давали воспроизводимые полиморфные фрагменты. Характеристика праймеров приведена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика праймеров, использованных в работе

№ п/п

Название праймера

Состав праймера

№ п/п

Название праймера

Состав праймера

1

IS1

(AG)8YG

6

IS6

(AG)8YT

2

IS2

(AC)8G

7

K10

(AC)8YG

3

IS3

(GA)8C

8

UBC809

(AG)8G

4

IS4

(CA)8A

9

UBC810

(GA)8T

5

IS5

(CA)8RC

10

UBC824

(TC)8G


Чтобы систематизировать результаты приняли обозначать полиморфные фрагменты некоторой буквой латинского алфавита, например, праймеру IS1 соответствует латинская буква A.

Таблица 2. Соответствие праймеров и букв латинского алфавита, используемых для записи полученных полиморфных фрагментов.

Название

праймера

IS1

IS2

IS3

IS4

IS5

IS6

K10

UBC809

UBC810

UBC824

Символ

A

B

C

D

E

F

G

H

I

L



При этом нижним индексом обозначали длину, а верхним индексом символом 1- наличие фрагмента; 0 – отсутствие фрагмента; 10- фрагмент есть, но выражен слабее, чем у других сортов, что наблюдается во всех случаях; ?- разные результаты наличия или отсутствия фрагмента. Например, обозначение 1A320 для сорта СН 78-07 свидетельствует о наличии полиморфного фрагмента длиной приблизительно 320 пар нуклеотидов при проведении ПЦР с праймером IS1 для каждой из трех выделенных проб.

Таблица 3. Результаты по полиморфным фрагментам, полученным при использовании праймеров IS1, IS2, IS3, IS4, IS5, IS6, K10, UBC809, UBC810, UBC824.


Название сорта

Общая формула полиморфных фрагментов

Сидерат 38

10A320 1B380 10B220 10B180 1C670 0C650 10C590 0C550 1C450 10D600 10D360 10D340 0D330 1D310 10E460 0F860 1F760 10F550 1G1350 1G480 10G450 1H320 1I290 10L570

СН 78-07

1A320 1B380 10B220 10B180 0C670 0C650 0C590 1C550 1C450 1D600 10D360 1D340 0D330 1D310 1E460 1F860 1F760 10F550 1G1350 0G480 10G450 1H320 1I290 10L570

Снежеть

?A320 10B380 10B220 10B180 1C670 0C650 1C590 10C550 1C450 1D600 ?D360 1D340 1D330 0D310 1E460 1F860 0F760 1F550 1G1350 0G480 10G450 1H320 10I290 1L570

Витязь

?A320 1B380 10B220 10B180 ?C670 ?C650 0C590 1C550 1C450 1D600 10D360 1D340 1D330 0D310 ?E460 1F860 ?F760 10F550 ?G1350 0G480 10G450 1H320 1I290 10L570

Смена

1A320 1B380 10B220 10B180 1C670 0C650 0C590 1C550 1C450 1D600 10D360 1D340 ?D330 1D310 1E460 1F860 1F760 1F550 10G1350 0G480 1G450 1H320 1I290 10L570

Радужный

10A320 0B380 10B220 10B180 1C670 0C650 1C590 10C550 0C450 1D600 1D360 1D340 1D330 0D310 1E460 1F860 0F760 10F550 1G1350 0G480 10G450 1H320 10I290 1L570

Кристалл

?A320 1B380 10B220 10B180 1C670 0C650 0C590 1C550 1C450 1D600 10D360 1D340 ?D330 ?D310 ?E460 1F860 1F760 1F550 1G1350 0G480 10G450 1H320 1I290 10L570

Вектор

10A320 1B380 10B220 1B180 1C670 0C650 1C590 1C550 1C450 1D600 10D360 1D340 0D330 1D310 10E460 1F860 1F760 1F550 1G1350 0G480 10G450 1H320 1I290 10L570

Узколистный

1A320 1B380 1B220 10B180 10C670 0C650 0C590 1C550 1C450 1D600 10D360 1D340 10D330 0D310 10E460 1F860 1F760 1F550 ?G1350 0G480 10G450 1H320 1I290 10L570

Белозерный 121

1A320 1B380 10B220 10B180 ?C670 0C650 0C590 1C550 1C450 1D600 10D360 1D340 0D330 1D310 1E460 1F860 1F760 1F550 10G1350 0G480 10G450 10H320 1I290 10L570


Наблюдаемый уровень полиморфизма позволяет проводить работу по паспортизации сортов исследуемого вида люпина и поиск молекулярных маркеров хозяйственно-ценных признаков.


Список литературы.


  1. Саук И. Б., Анохина В. С., Тимошенко М. К., Цибульская И. Ю., Брыль Е. А. Морфогенетические и биохимические исследования коллекции желтого и узколистного люпина // Молекулярная и прикладная генетика. 2008. Том 8. С. 133-142.

  2. Вишнякова М. А. О перспективах введения в культуру и интродукции различных видов люпина // Сельскохозяйственная биология. 2005. № 2. С. 101 – 109.

  3. Kurlovich B.S., Repyev S.I. The gene bank and breeding of grain legumes (lupine, vetch, soya, and beah) // St. Petersburg:N.I. Vavilov Institute of Plant Industry. 1995. 438p.

  4. Кочиева Е. З. Молекулярное маркирование сортов баклажанов (Solanum melongena L.) // Сельскохозяйственная биотехнология. Под. ред. Шевелухи В. С. 2000. т. 1. С. 17 — 24

  5. Tikunov Yu. M., Khrystaleva L. I. Application of ISSR markers in the genus Lycopersicon // Euphitica. 2003. № 131. С. 71-80.

  6. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucler Acid Res. 1990. V. 18. 7213-7218.

  7. Дрейпер Дж. Генная инженерия растений: Лабораторное руководство / Пер. с англ / Дж. Дрейпер, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена: Под ред. Дж. Дрейпера. Москва, 1991.

Добавить в свой блог или на сайт

Похожие:

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconОльга Викторовна формирование умений самообразования у будущих учителей безопасности жизнедеятельности в вузе
Защита состоится 17 ноября 2010 г в 12. 00 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций...

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconРазвитие духовности студентов коммуникативных
Защита состоится «25» апреля 2011 г в 12: 00 часов на заседании диссертационного совета дм 212. 020. 04 при Брянском государственном...

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconФормирование профессионально значимых ценностей медицинского работника среднего звена в условиях дополнительного образования
Защита состоится «8» июня 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета дм 212. 020. 01 в Брянском государственном университете...

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconЭтос старообрядчества и сектантства второй половины XIX начала XX вв.: по материалам Черниговской и Орловской губерний
Защита состоится 15 апреля 2011 г в 13. 00. на заседании диссертационного совета д 212. 020. 02 при Брянском государственном университете...

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconА. В. Артюхова Брянский государственный университет им акад. И. Г. Петровского e-mail
В настоящее время во всем мире остро ощущается дефицит белка. В связи с этим все большее значение приобретают растительные белки....

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconПрименение современных материалов в автосцепном устройстве грузового вагона
Брянский государственный технический университет 241035, г. Брянск, бул. 50-летия Октября, e-mail: v-T

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconПравила приёма в аспирантуру фгбоу впо «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского»
Фгбоу впо «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского»

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconБрянский государственный университет имени академика и. Г. Петровского кафедра философии
Кафедра философии Брянского государственного университета имени академика И. Г. Петровского приглашает принять участие в III международной...

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconПо приказу №59 от 25. 02. 09
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Брянский государственный...

С. Ю. Гришин Брянский государственный университет им. Акад. И. Г. Петровского, 241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. E-mail iconФгбоу впо «брянский государственный университет имени академика и. Г. Петровского»
«Проблемы и перспективы развития физической культуры и спорта в современных условиях»


Разместите кнопку на своём сайте:
lib.convdocs.org


База данных защищена авторским правом ©lib.convdocs.org 2012
обратиться к администрации
lib.convdocs.org
Главная страница